腸-肝類器官串聯(lián)共培養(yǎng)研究藥物吸收和毒性過(guò)程

為了彌補(bǔ)動(dòng)物模型的局限性，提出了新的藥物安全性評(píng)估模型，以完善和減少現(xiàn)有的模型。為了在體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)（MPS）中模擬藥物的吸收和代謝，并預(yù)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)和毒性效應(yīng)，中國(guó)食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所（國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，德國(guó)TissUse GmbH公司的科學(xué)家一起合作，建立了一個(gè)腸-肝臟串聯(lián)培養(yǎng)芯片，檢測(cè)了APAP（對(duì)乙酰氨基酚）過(guò)量后的急性肝臟損傷過(guò)程，并于2024年9月發(fā)表于《Food and Chemical Toxicology》雜志。

使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞系建立了腸類器官，同時(shí)利用 HepG2、HUVEC-T1 和經(jīng) PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 以及人類肝臟星狀細(xì)胞建立了肝臟類器官。使用高效液相色譜法測(cè)定 APAP 濃度，并使用 Phoenix 軟件通過(guò)非房室分析法擬合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。肝臟損傷生物標(biāo)志物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的變化，以及肝臟功能標(biāo)志物白蛋白表明，這兩個(gè)器官芯片模型在 4 天內(nèi)的短期培養(yǎng)是穩(wěn)定的。在給藥對(duì)乙酰氨基酚（APAP）后，活性氧信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)線粒體膜電位降低，caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）被激活，p53 信號(hào)增強(qiáng)，表明 APAP 過(guò)量引發(fā)了毒性反應(yīng)。在腸肝臟多器官系統(tǒng)模型中，我們擬合了毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并模擬了 APAP 過(guò)量后的肝臟毒性過(guò)程，這將有助于器官芯片在藥物毒性檢測(cè)中的應(yīng)用。

1. 引言

藥物性肝臟損傷（DILI）是藥物研發(fā)的主要障礙，會(huì)導(dǎo)致藥物撤市（2021 年；2016 年）。動(dòng)物模型與人體之間的差異以及日益嚴(yán)格的倫理要求，使得有必要采用新的藥物安全性評(píng)估模型（2014 年）。這種微生理系統(tǒng)（MPS），也稱為“芯片上的器官”，是一種通過(guò)結(jié)合微流控、微制造和三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的裝置。它能夠?yàn)閯?dòng)物模型重現(xiàn)生理相關(guān)的器官功能。MPS平臺(tái)是一種微型化的體外生理環(huán)境（Shinohara等，2021）。

這使得能夠模擬和精確控制化學(xué)梯度和生物力學(xué)力，以模擬體內(nèi)環(huán)境并響應(yīng)。預(yù)定義的微流控通道充當(dāng)工程化的血管，重現(xiàn)體內(nèi)生理組織功能（Low 等，2020 年），并允許與其他多器官系統(tǒng)聯(lián)合（Kulthong 等，2020 年）。此外，多器官系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)組織功能監(jiān)測(cè)（Milani 等，2022 年）。

由微流道串聯(lián)的多器官芯片模型能夠進(jìn)一步模擬人類動(dòng)態(tài)反應(yīng)和內(nèi)部器官相互作用（Arakawa 等，2020 年），并為藥物暴露與藥物效果/毒性的關(guān)系提供輔助證據(jù)。腸和肝臟是主要的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）器官，因此在藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究中非常重要（Vernetti 等，2017 年）。

口服藥物通過(guò)消化道和腸直接吸收進(jìn)入血液，影響藥物的生物利用度和全身劑量。腸芯片模型可以模擬藥物吸收，并描繪藥物的 ADME 和血藥濃度（Milani 等，2022 年）。Lee 等（2017 年）建立了一個(gè)三維腸肝臟芯片來(lái)描繪對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的藥代動(dòng)力學(xué)模型，而 Arakawa 等（2020 年）構(gòu)建了一個(gè)腸-肝臟模型，用于SAN唑侖的連續(xù)代謝的體外定量推算。Milani 等（2022 年）評(píng)估了由于腸和肝臟對(duì)麥考酚酯代謝而產(chǎn)生的藥物前體麥考酚酯的量。因此，類似的方法可以應(yīng)用于其他多器官的 MPS，以研究人體內(nèi)的藥效學(xué)過(guò)程。

目前僅有少數(shù)關(guān)于同時(shí)進(jìn)行毒性檢測(cè)和樣本鑒定的多器官芯片系統(tǒng)的例子被報(bào)道。Liu等（2020 年）基于基于腸、血管、肝臟和腎臟芯片的多器官芯片系統(tǒng)研究了人參皂苷復(fù)合物 K 的吸收、代謝和毒性。Jeon等（2021 年）報(bào)道了一種腸肝臟芯片，重現(xiàn)了脂肪酸的吸收以及隨后在肝臟中的脂質(zhì)積累。

為了探索體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)，在此，我們通過(guò)將腸培養(yǎng)物與使用四種細(xì)胞系構(gòu)建的 3D 肝臟球體串聯(lián)在二聯(lián)器官芯片（2OC）上，開(kāi)發(fā)了一種可重復(fù)的腸-肝臟的二聯(lián)器官芯片。我們通過(guò)檢測(cè)功能生物標(biāo)志物和蛋白質(zhì)的水平來(lái)剖析芯片功能，然后在芯片中通過(guò)向腸腔室添加肝臟毒性化合物對(duì)乙酰氨基酚（APAP）來(lái)測(cè)試肝臟毒性，以模擬藥物吸收后的肝臟毒性。經(jīng)過(guò) 48 小時(shí)的孵育，檢測(cè)了兩個(gè)腔室中的藥物分布和肝臟毒性信號(hào)。

2. 材料和方法

2.1. 細(xì)胞與培養(yǎng) 細(xì)胞資源及培養(yǎng)方法見(jiàn)補(bǔ)充信息。

2.2. 腸的培養(yǎng)

為了在 Transwell 培養(yǎng)板上構(gòu)建腸模型，以 1 ×10-6 細(xì)胞/孔的密度將 Caco-2 細(xì)胞接種到 Transwell 培養(yǎng)板（默克公司，PIHP01250）中。將 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞以 9:1 的比例混合，并以相同的濃度接種到每個(gè)培養(yǎng)板中。從第 0 天到第 7 天，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，第 7 天之后每天更換一次。

2.3. 3D（肝臟）的培養(yǎng)

基于我們之前的研究（Sun 等，2024 年），THP-1 細(xì)胞在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中稀釋至 5 ×10-5 細(xì)胞/毫升，然后用 25 納摩爾的佛波酯酰基乙酸（PMA，MedChemExpress）處理 48 小時(shí)，在 6 孔板中進(jìn)行。隨后在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時(shí)并用 TryplE（Gibco）進(jìn)行篩選，經(jīng) PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞被收集。   2   HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 T1、THP-1 以及人類肝臟星狀細(xì)胞（HHSC）消化后收集，細(xì)胞懸液以 60:19:15:6 的比例混合。為了形成等量細(xì)胞，稀釋后每孔接種 100 個(gè)細(xì)胞到圓底 U 型低貼壁 96 孔板（深圳肝臟生物技術(shù)有限公司，LV-ULA002-96UW）中。每?jī)商旄鼡Q一半培養(yǎng)基。 使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀（珀金埃爾默公司，Opretta 系列）對(duì)球形形態(tài)進(jìn)行了觀察和測(cè)量。

2.4. 基于芯片的腸-肝臟共培養(yǎng)

HUMIMIC Chip2 24 孔板（德國(guó) TissUse GmbH）是按照推薦方案（Wagner 等，2013 年）制備的。在腸模型建立后的第 14 天，將 Transwell 細(xì)胞嵌體添加到 24 孔培養(yǎng)室中，并將 50 個(gè)球體添加到 96 孔培養(yǎng)室中，以形成腸-肝臟芯片模型。

根據(jù)之前的方法（Lin 等，2020 年），在2OC 微流道循環(huán)中，使用600 ul循環(huán)培養(yǎng)基和 400 ul位于屏障頂部的培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)。

肝臟腔室中的培養(yǎng)基每天更換一次，并且收集并更換一半的循環(huán)上清液。在 7 天共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，使用免疫熒光法分析肝臟的器官特異性功能標(biāo)志物。將片上微流泵設(shè)置為 0.8 Hz的頻率。

2.5. 腸類器官的完整性

在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量熒光素鈉和 40 kDa熒光異硫氰酸熒光素 - 葡聚糖的跨內(nèi)皮電阻（TEER）和腸表觀通透性系數(shù)（Papp），以評(píng)估腸類器官的完整性。方法見(jiàn)補(bǔ)充信息。

2.6. 肝臟類器官的性能評(píng)估

在肝臟模型中，選擇了一種靈敏的雙色熒光細(xì)胞活力測(cè)定法來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。使用鈣黃綠熒光素 AM（一種細(xì)胞可滲透染料）作為活細(xì)胞指示物，使用碘化 BOBO-3（Invitrogen 公司）作為死細(xì)胞指示物?；罴?xì)胞成分在活細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)烈、均勻的綠色熒光（激發(fā)/發(fā)射 488 納米/515 納米），而死細(xì)胞成分主要產(chǎn)生細(xì)胞核紅色熒光（激發(fā)/發(fā)射 570 納米/602 納米）。 在使用建立的肝臟器官芯片模型獲得的上清液中測(cè)量了各種生物標(biāo)志物。我們?cè)u(píng)估了白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，這些是肝臟代謝和損傷的指標(biāo)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 Cell Titor Glo 3D（Promega）測(cè)量了三磷酸腺苷（ATP）的含量。 膽酰基-賴氨酸-熒光素（CLF）是一種熒光素標(biāo)記的膽汁酸，其生物學(xué)行為與天然膽?；拾彼岱浅Ｏ嗨啤榱嗽谌S肝臟模型中可視化膽管，我們制備了 20 微摩爾的 CLF 儲(chǔ)備液，并將模型在 37°C 下孵育 2 小時(shí)。用 Hoechst 33342 染色并孵育 10 分鐘。細(xì)胞用無(wú)酚紅培養(yǎng)基沖洗三次，并在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 498/517 納米處檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.7. 形態(tài)學(xué)與免疫染色

如前所述（Sun 等，2024 年），腸和肝臟的等量切片用多聚甲醛固定，并用蔗糖溶液脫水。冷凍切片在染色前先用蘇木精-伊紅（HE）染色、高碘酸-希夫（PAS）染色或免疫染色進(jìn)行切割。對(duì)于免疫染色，切片先用 PBS 沖洗三次     用含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 處理細(xì)胞，處理時(shí)間及穿孔處理 10 分鐘，用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘，在室溫下進(jìn)行。按照說(shuō)明書以一定稀釋度向每個(gè)孔中加入一抗原位體，并在 4℃下孵育過(guò)夜。使用以下一抗原位體：抗 Occludin（91131S，CST，1:400 稀釋度）、抗 ZO-1（ab221547，Abcam，1:100 稀釋度）、抗 MRP2（ab172630，Abcam，1:500 稀釋度）和抗 PGP（貨號(hào) 25081-2-AP，ProteinTech，1:500 稀釋度）。清洗細(xì)胞，用相應(yīng)的熒光偶聯(lián)二抗原位體處理，并與 DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀或顯微鏡（奧林巴斯 IX71）觀察明視野形態(tài)和切片。 對(duì)于原位免疫熒光染色，腸膜和 3D 肝臟模型用 PBS 沖洗三次，并用 4%多聚甲醛固定 30 分鐘。接下來(lái)，樣本在含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 中穿孔處理 10 分鐘，并在室溫下用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘。 按照說(shuō)明書，將稀釋后的原位抗體以一定稀釋度加入每個(gè)孔中，并在4℃下孵育過(guò)夜。使用的原位抗體包括：抗Occludin（91131S，CST，1:400稀釋）、抗ZO-1（sc-33725，Santa Cruz Biotechnology，1:500稀釋）、抗MRP2（ab172630，Abcam，1:500稀釋）、抗ABCB11/BSEP（ab255605，Abcam，1:100稀釋）、抗PGP（Cat No. 25081-2-AP，ProteinTech，1:500稀釋）、抗CYP3A4（MA5-17064，ThermoFisher，1:1000稀釋）、抗Ki67（9449S，CST，1:10,000稀釋）、抗CD31（3528S，CST，1:100稀釋）、抗CD68（ab213363，Abcam，1:100稀釋）、抗SMA（14395-1-AP，ProteinTech，1:100稀釋）、抗裂解的caspase-3（9664S，CST，1:400稀釋）和抗p53（2524S，CST，1:2000稀釋）。細(xì)胞經(jīng)過(guò)洗滌，與熒光偶聯(lián)的次級(jí)抗體孵育，并與DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用的次級(jí)抗體包括：山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150077，Abcam，1:1,000稀釋）、山羊抗鼠IgG（H + L）（Alexa Fluor® 555 Conjugate）（4417，CST，1:1000稀釋）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150113，Abcam，1:1,000稀釋）。結(jié)果通過(guò)高含量分析和熒光顯微鏡進(jìn)行評(píng)估。

2.8. 藥物毒性和細(xì)胞活力測(cè)定

如前所述（Sun 等，2024 年），使用 Cell Titor Glo 檢測(cè)細(xì)胞活力，并測(cè)定細(xì)胞存活率和細(xì)胞存活率（%）。在 96 孔板中，以 1 ×10-4細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到 96 孔板中；次日丟棄上清液，并與對(duì)乙酰氨基酚（4 毫摩爾）一起培養(yǎng)。使用同樣的方法測(cè)定球體的存活率。該檢測(cè)使用光度計(jì)進(jìn)行。

2.9. 阿司匹林在共培養(yǎng)芯片中的模擬口服過(guò)程

加載了 7 個(gè) 2OC 模型，其中 4 個(gè)微流道給藥對(duì)乙酰氨基酚（APAP），其余回路未給予。為了模擬口服過(guò)程以及 APAP 誘導(dǎo)的肝臟毒性后果，在加載 2OC 回路后的第二天，向插入物頂部加入 400 微升 10 毫摩爾的 APAP。在 0、0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時(shí)分別收集 10 微升上清液用于液相色譜定量分析。在給藥 48 小時(shí)后，收集上清液用于各種生物標(biāo)志物的測(cè)量以評(píng)估透皮電阻（TEER）。同時(shí)收集肝臟球體用于肝臟毒性評(píng)估。我們還至少收集了 3 - 5 個(gè)用于細(xì)胞活力測(cè)定，其余部分轉(zhuǎn)移到 96 孔板中保存以用于熒光染色。

2.10. 共培養(yǎng)芯片的肝臟毒性評(píng)估

根據(jù)推薦的試劑盒方案，測(cè)量細(xì)胞活力以及白蛋白（ALB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平，以評(píng)估藥物給藥 48 小時(shí)后的肝臟損傷情況。使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（Beyotime Biotechnology，C2001S）進(jìn)行測(cè)定線粒體膜電位。將 2OC 芯片的 3D 包埋肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 Ex/Em = 550/575 和 350/461 納米檢測(cè)四甲基羅丹明乙酯（TMRE）和 Hoechst 33342 的熒光信號(hào)。使用 CellROX 氧化應(yīng)激試劑（賽默飛世爾科技，C10444）測(cè)定氧化應(yīng)激。 將 2OC 芯片的 3D 嵌入式肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 485/520 納米和 350/461 納米檢測(cè) CellROX 和 Hoechst 33342 的熒光信號(hào)。使用免疫熒光染色法檢測(cè)原位 Ki-67、裂解的 caspase-3 和 p53 信號(hào)，以評(píng)估細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡情況。

2.11. 樣本定量

基于之前的方法（Marin 等，2019 年），使用高效液相色譜法（HPLC）（島津，LC-2040C 3D）測(cè)量對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的濃度。基底側(cè)腔室（肝臟腔室）用新鮮培養(yǎng)基填充，而頂側(cè)腔室暴露在對(duì)乙酰氨基酚培養(yǎng)基中。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，如第 2.9 節(jié)所述，從兩側(cè)各取 10 微升樣本。選擇甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑，在加入 30 微升甲醇以沉淀蛋白質(zhì)后，通過(guò)離心機(jī)（13000 轉(zhuǎn)/分鐘，4℃，15 分鐘）去除沉淀物。使用惰性可持續(xù) C18（150 毫米長(zhǎng)度，內(nèi)徑 4.6 毫米，粒徑 5 微米，島津）色譜柱。使用兩種流動(dòng)相：溶劑 A（甲醇）和溶劑 B（蒸餾水），流速為 0.8 毫升/分鐘。溶劑組成在 0 - 4 分鐘為 5% A，4.01 - 10 分鐘為 5 - 100% A，10.01 - 15 分鐘為 5% A。進(jìn)樣量為 10 微升，檢測(cè)使用光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（波長(zhǎng) 280 納米）。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的濃度。 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用非房室模型（NCA）在 Phoenix WinNonlin（Certara，美國(guó)）中進(jìn)行擬合。采用線性梯形線性插值法作為計(jì)算方法，模型類型定義為血漿，劑量選項(xiàng)定義為血管外。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定的肝臟隔室中的對(duì)乙酰氨基酚（APAP）濃度 - 時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以確定 0 至 48 小時(shí)下的曲線下面積（AUC）。峰值濃度（Cmax）和達(dá)峰時(shí)間（Tmax）直接從個(gè)體濃度與時(shí)間曲線中讀?。ǜ叩龋?022 年；王等，2022 年）。 采用超高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）檢測(cè) NAPQI 的信號(hào)（張等，2018 年）。通過(guò)將 N-乙?；鶎?duì)苯二酚亞胺（NAPQI）（MCE，HY-66005）溶解在甲醇中制備濃度為 1 毫克/毫升的儲(chǔ)備溶液，并用甲醇進(jìn)一步稀釋至 1 微克/毫升的工作溶液。對(duì) NAPQI 的形成進(jìn)行了分析。 在服用對(duì)乙酰氨基酚（APAP）后 0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時(shí)，使用配備 AB SCIEX LC AC 系統(tǒng)、PDA 檢測(cè)器和三重四極桿 6600+儀器的超高效液相色譜 - 質(zhì)譜法（UPLC-MS）進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)使用沃特斯 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 毫米×50 毫米）實(shí)現(xiàn)了色譜分離。 1.7 微米）。使用的洗脫液為（A）0.1%（體積比）的甲酸水溶液和（B）甲醇，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，如表S1所示。超高效液相色譜流速為0.3 mL/min，超高效液相色譜-質(zhì)譜分析使用10 微升樣品。對(duì)應(yīng)于解聚電位、碰撞能量、碰撞能量分布和溫度的離子對(duì)特征為m/z 149.98-108.04（30、30、15和350），對(duì)應(yīng)于NAPQI。

2.12. 統(tǒng)計(jì)分析

連續(xù)變量以均值±偏差（標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)來(lái)研究?jī)蓚€(gè)獨(dú)立樣本之間的差異。數(shù)據(jù)分析使用 IBM SPSS Statistics 25 版（IBM 公司）進(jìn)行。線性回歸模型使用 SPSS 和 GraphPad Prism 7.00（GraphPad 軟件）進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義設(shè)定為 P≤0.05。

3. 結(jié)果

3.1. 類器官的培養(yǎng)

將細(xì)胞混合物以 1 ×10-6、5 ×10-5 和 2.5 ×10-5 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到 Transwell 培養(yǎng)板中，以獲得體外腸模型。所有組的跨上皮電阻（TEER）在 21 天內(nèi)均達(dá)到 300 Ω cm2，其中高密度共培養(yǎng)組在 12 天內(nèi)達(dá)到 300 Ω cm2（圖 1A）。在第 14 天，高密度共培養(yǎng)組模型中熒光素鈉和熒光素葡聚糖均符合滲透性測(cè)試要求（圖 1B）。當(dāng)跨上皮電阻達(dá)到 200 - 1000 Ω cm2 時(shí)，Caco - 2 單層可被視為完整（Iftikhar 等，2020 年）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇高密度共培養(yǎng)組來(lái)形成腸屏障。 緊密連接蛋白 Occludin 和 ZO-1 經(jīng)過(guò)染色，以顯示其在腸等值物培養(yǎng)條件下的完整性。在第 7 天和第 21 天，我們觀察到 Occludin 的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖 1C），而在第 14 天和第 21 天的切片中，Occludin 和 ZO-1 呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖 1D，圖 S1A），表明在第 14 天腸屏障被視為完整的。在第 14 天和第 21    天，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2 和 PGP 分布在腸切片的一側(cè)（圖 1E，圖 S1B），表明腸模型的極性。總體而言，結(jié)果表明在第 14 天獲得的腸等值物具有緊密連接和極性；因此，在第 14 天腸屏障被視為成熟的，并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 在圖 2A 中，模型的直徑在 10 天內(nèi)迅速增大，并穩(wěn)定在約 400 微米。HE 染色顯示在第 7 天（圖 2B）沒(méi)有明顯的壞死核心，但在第 10 天（圖 2B）有輕度壞死核心或幾個(gè)細(xì)胞凋亡，在第 14 天（圖 S1I）有嚴(yán)重的中心壞死區(qū)域。與活/死細(xì)胞染色（圖 2C）所示的死細(xì)胞分布一致，在第 10 天檢測(cè)到更多的死細(xì)胞。模型中 ATP 的總量持續(xù)增加（圖 S1C），而乳酸脫氫酶（LDH）的分泌沒(méi)有顯著增加（圖 S1D）。模型穩(wěn)定生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死細(xì)胞數(shù)量增加，通過(guò)檢測(cè)上清液中的 LDH 水平無(wú)法檢測(cè)到內(nèi)部壞死細(xì)胞。為避免壞死細(xì)胞核的形成，這些結(jié)果表明培養(yǎng)時(shí)間限制為 7 天。 在第 7 天（圖 2D）和第 10 天，分別通過(guò) CD31、CD68 和α-SMA 信號(hào)來(lái)追蹤人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 T1（HUVEC-T1）、人肺泡巨噬細(xì)胞 THP-1 和人肝臟星狀細(xì)胞 HHSC 的熒光信號(hào)，采用免疫熒光染色法進(jìn)行追蹤。

圖 S1G 表明，上述三種細(xì)胞類型在第 10 天仍存在于球體中。在第 7 天檢測(cè)了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP（圖 2E），并通過(guò)熒光探針 CLF 追蹤了膽汁酸外排的功能（圖 S1H）。CLF 是 MRP2 和 BSEP 的底物（Boaglio 等，2010 年），CLF 信號(hào)也表明了這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在類器官中的功能。   最后，PAS 染色顯示有糖原沉積（圖 2B），ALB 和 UREA 的增加趨勢(shì)表明，即使在細(xì)胞死亡緊急情況下，肝臟的總合成代謝功能也未受阻礙（圖 S1E - F）。這些結(jié)果表明，在 14 天內(nèi)，類器官對(duì)肝臟功能的影響相對(duì)穩(wěn)定。  

3.2. 腸-肝臟芯片的建立及功能概況

在腸模型建立的第十四天，將腸和 50 個(gè)肝臟類器官分別裝入單獨(dú)的隔間，以形成腸-肝臟-芯片模型。相互連接的隔間使得液體能夠在通道和腔室中循環(huán)，促進(jìn)了兩種類器官的共培養(yǎng)。 2OC 系統(tǒng)維持了7天。圖3總結(jié)了建立2OC模型后體外細(xì)胞活力以及腸和肝臟功   能。我們監(jiān)測(cè)了TEER水平（圖3A）以評(píng)估腸屏障的維持情況，盡管有波動(dòng)，但TEER始終保持在300以上，表明即使與肝臟等量物共培養(yǎng)，腸屏障的完整性也得到了持續(xù)保持。在培養(yǎng)期間，測(cè)量了肝臟腔室中肝臟功能指標(biāo)ALB（圖3B）和UREA（圖3C）的水平。ALB水平在前3天增加，然后下降，而UREA水平?jīng)]有顯著變化。此外，還評(píng)估了LDH、AST和ALT水平以確定腸和/或肝臟類器官的細(xì)胞活力（圖 3E 和 F）。兩個(gè)腔室的乳酸脫氫酶（LDH）水平略有升高，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高。這些結(jié)果表明 2OC 系統(tǒng)內(nèi)的功能和細(xì)胞活力發(fā)生了變化，表明盡管維持了腸類器官的完整性，但總體肝臟器官功能和細(xì)胞活力意外下降。 接下來(lái)，對(duì)從 2OC 芯片和 U 底 96 孔板獲得的肝臟類器官進(jìn)行免疫染色信號(hào)的比較（圖 3G）。首先，在 U 底板培養(yǎng)時(shí)，主要觀察到 Ki67 信號(hào)沿球體邊緣分布，并且在球體內(nèi)部均勻分布，盡管在 2OC 芯片共培養(yǎng) 7 天后，其強(qiáng)度較弱。在 U 底板上培養(yǎng)時(shí)，沿肝臟球體邊緣的 PGP、MRP2 和 BSEP 信號(hào)更強(qiáng)，并且在球體內(nèi)部也能檢測(cè)到。在 2OC 芯片共培養(yǎng) 7 天后，觀察到沿邊緣有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信號(hào)，PGP 和 MRP2 的信號(hào)強(qiáng)度略強(qiáng)于在 U 底板培養(yǎng)的信號(hào)。最后，從兩種培養(yǎng)方法來(lái)看，細(xì)胞色素 P450（CYP）3A4 信號(hào)在球體中呈分散狀態(tài)，2OC 模型的信號(hào)略有增強(qiáng)。這些結(jié)果描述了肝臟類器官的基本功能，并表明在 2OC 芯片中的肝臟球體中 Ki67、PGP 和 MRP2 的表達(dá)與在 U 底板中的有所不同。

3.3. 在 2OC 二聯(lián)器官芯片中對(duì)過(guò)量對(duì)乙酰氨基酚的毒性評(píng)估

在對(duì) 2OC 芯片進(jìn)行測(cè)試之前，將 HepG2 和 Caco-2 細(xì)胞暴露于不同濃度的對(duì)乙酰氨基酚（APAP）48 小時(shí)。當(dāng)濃度超過(guò) 16 毫摩爾時(shí)，觀察到 Caco-2 細(xì)胞的存活率急劇下降（圖 S2A），而當(dāng) APAP 濃度   超過(guò) 2 毫摩爾時(shí)，HepG2 細(xì)胞的抑制率超過(guò) 20%（圖 S2A）。這些結(jié)果表明，在 2 - 16 毫摩爾的 APAP 范圍內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的肝臟毒性，但在 Caco-2 細(xì)胞中未檢測(cè)到明顯的毒性作用。在肝臟類器官中，當(dāng)濃度超過(guò) 2.5 毫摩爾時(shí)，細(xì)胞存活率降至 80%以下（圖 S2B），用 4 毫摩爾的 APAP 處理 48 小時(shí)后，測(cè)得肝臟類器官的存活率為 70.69 ± 26.97%，與在 HepG2 細(xì)胞中觀察到的明顯毒性趨勢(shì)一致。 基于這些結(jié)果，選擇該劑量進(jìn)行腸類器官的進(jìn)一步測(cè)試。為了達(dá)到最終濃度為4 mM，從頂側(cè)施用10 mM的APAP，持續(xù)48小時(shí)，并測(cè)量存活率和TEER，以評(píng)估腸細(xì)胞的活力和屏障功能。與對(duì)照組相比，藥物施用后細(xì)胞活力沒(méi)有顯著下降（圖S2C）。盡管TEER顯示出下降趨勢(shì)（圖S2D），但仍保持在300 Ω cm2以上，符合腸屏障完整性的要求。這些結(jié)果表明，APAP對(duì)肝臟細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，但在所檢測(cè)的濃度下不會(huì)損害腸的屏障功能。 在 2OC 芯片中，含有成熟腸類器官的頂部分室在濃度為 10 毫摩爾的阿司匹林（APAP）的條件下進(jìn)行了添加。48 小時(shí)后，基底側(cè)室顯示每個(gè)球體有 83.94%的存活率，略高于 U 底板的存活率（70.69%）。盡管在跨上皮電阻（TEER）方面未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖 4A）。 在這兩組之間，AST（圖 3B）（P < 0.05）和 ALT（圖 3C）水平與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)，而治療 48 小時(shí)后 ALB 水平下降（圖 3D）。AST、ALT 和 ALB 反映了肝臟損傷，而 TEER 水平未反映腸道屏障損傷的嚴(yán)重情況。

最后，我們檢測(cè)到了 APAP 處理后熒光信號(hào)的變化。檢測(cè)到 Ki67 信號(hào)反映了細(xì)胞增殖能力的變化（圖 4E）。在對(duì)照組中，Ki67 信號(hào)主要集中在側(cè)面，并且在球體內(nèi)部觀察到散布信號(hào)。與對(duì)照組相比，治療后的 Ki67 信號(hào)在側(cè)面變得不顯著，信號(hào)主要集中在內(nèi)部，這可能是由于最外層細(xì)胞比內(nèi)部細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間暴露于對(duì)乙酰氨基酚（APAP），增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。接下來(lái)，檢測(cè)了 CellROX 水平，并且在 APAP 組中觀察到更強(qiáng)的信號(hào)（圖 4F）。在肝臟球體中觀察到 APAP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且最初使用 TMRE 來(lái)評(píng)估線粒體膜電位（圖 4G）。在 APAP 組中，側(cè)面的信號(hào)強(qiáng)度降低，而對(duì)照組中信號(hào)分布更均勻，表明在給予 APAP 后，球體內(nèi)部側(cè)向細(xì)胞的線粒體膜電位降低。 在 2OC 芯片上孵育 48 小時(shí)后，急性胰腺炎（APAP）組中凋亡蛋白裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（圖 4H）和 p53（圖 4I）的表達(dá)顯示裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 信號(hào)更強(qiáng)，p53 信號(hào)略有增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，在 2OC 芯片中孵育 48 小時(shí)后，可以檢測(cè)到急性胰腺炎誘導(dǎo)的肝臟球體增殖抑制、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

3.4. 藥物在 2OC 二聯(lián)器官芯片中的吸收與代謝

圖5A、B展示了藥物濃度在各腔室隨時(shí)間的演變。在腸腔室中觀察到對(duì)乙酰氨基酚濃度迅速下降（圖5A），同時(shí)在肝臟腔室中檢測(cè)到的藥物濃度相應(yīng)增加（圖5B）。在24小時(shí)時(shí)，腸和肝臟腔室中分別檢測(cè)到3.93 ±0.46 mM和3.68 ±0.41 mM的對(duì)乙酰氨基酚。盡管吸收過(guò)程易于觀察，但代謝過(guò)程并不容易模擬，這從對(duì)乙酰氨基酚濃度的不顯著下降可以看出，這可能是由于藥物劑量過(guò)大所致。即使藥物總濃度呈下降趨勢(shì)（圖5C），下降趨勢(shì)也不僅僅是由于采樣或藥物代謝。我們通過(guò)參考32小時(shí)測(cè)量的濃度計(jì)算了48小時(shí)無(wú)代謝的對(duì)乙酰氨基酚的理論總量。當(dāng)沒(méi)有細(xì)胞代謝發(fā)生時(shí)，對(duì)乙酰氨基酚的量應(yīng)該為3.16 ±0.53 mol；然而，實(shí)際檢測(cè)到的量為2.95 ±0.20 mol。這些結(jié)果表明，即使藥物過(guò)量，使用我們的2OC芯片也可以模擬藥物的吸收和代謝過(guò)程。接下來(lái)。我們檢測(cè)到了有毒代謝產(chǎn)物 NAPQI，在上清液中未檢測(cè)到該物質(zhì)。 為了精確描述 2OC 芯片中的藥物吸收過(guò)程，我們使用 NCA 模型計(jì)算了對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的藥物吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)。計(jì)算得出的 Tmax（達(dá)峰時(shí)間）、Cmax（峰值濃度）和 AUC（曲線下面積）分別為 24 ±11.31 h、3.98 ±0.59 mM 和 157.73 ±14.88 h mM。然而，由于 APAP 濃度下降極小，很難擬合藥物消除動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4. 討論

本研究利用體外腸-肝臟多器官芯片平臺(tái)評(píng)估藥物吸收，并預(yù)測(cè)毒代動(dòng)力學(xué)及其毒性作用。我們通過(guò)在 2OC 多器官芯片平臺(tái)上耦合兩個(gè)獨(dú)立器官構(gòu)建了一個(gè)腸-肝臟芯片系統(tǒng)，以重現(xiàn)口服對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的連續(xù)藥物吸收以及隨之而來(lái)的急性肝臟損傷。在 2OC 系統(tǒng)中，APAP 的吸收率和毒性作用與已知的體內(nèi)處理過(guò)程一致。這些結(jié)果表明，在我們的 2OC 模型中可以模擬吸收過(guò)程，并且在存在上游腸器官的情況下，可以檢測(cè)到毒性作用，這與先前的報(bào)告一致。我們的發(fā)現(xiàn)為未來(lái)將多個(gè)器官耦合的多器官芯片模型作為輔助模型用于藥物毒性預(yù)測(cè)提供了支持。 基于人類小腸中腸上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的比例，使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞進(jìn)行腸構(gòu)建（Chen 等，2017 年；Tsamandouras 等，2017 年）?；诮】蹈闻K中細(xì)胞成分的比例創(chuàng)建肝臟球體（Weiler-Normann 和 Rehermann，2004 年）?；谙惹暗难芯?，我們?cè)趦芍艿墓才囵B(yǎng)中檢測(cè)了結(jié)構(gòu)和肝臟功能。HUVEC-T1 誘導(dǎo)的 THP-1 和 HHSC 的 CD31（Newman，1997 年）、CD68（Gao 等，2018 年）和α-SMA（Chiabotto 等，2021 年）標(biāo)志物的信號(hào)表明了 10 天共培養(yǎng)后的細(xì)胞分布。慢性肝臟功能衰竭（CLF）的積累（Hopwood 等，2006 年）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2、BSEP 和 PGP（Rendic，2021 年）以及白蛋白（ALB）和尿素（UREA）水平的增加（Baudy 等，2020 年）分別說(shuō)明了膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物外排功能和合成代謝功能增強(qiáng)。慢性肝臟功能衰竭在 3D 球體的管狀結(jié)構(gòu)中積累（Ramaiahgari 等，2014 年），該信號(hào)表明在培養(yǎng) 7 天后形成了初步的管狀結(jié)構(gòu)。 我們基于我們的腸和肝臟類器官構(gòu)建了一個(gè)基于微流控裝置的腸-肝臟芯片（Marin 等，2019 年；Maschmeyer 等，2015 年）。其他腸-肝臟模型表明，器官表面積和代謝能力會(huì)影響口服藥物的吸收和代謝（Lee 等，2017 年）。使用天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（Meunier 和 Larrey，2019 年）來(lái)評(píng)估肝臟毒性。3 天共培養(yǎng)后，其增加趨勢(shì)表明存在潛在的肝臟細(xì)胞損傷，而白蛋白（ALB）的減少趨勢(shì)可能是由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足、藥物給藥、營(yíng)養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)攝入量減少以及肝臟損傷（Belinskaia 等，2020 年；Meunier 和 Larrey，2019 年）。 在本研究中，CYP3A4 信號(hào)略有增強(qiáng)，這與之前的研究結(jié)果一致，表明 CYP3A4 的活性在腸-肝臟共培養(yǎng)后得到增強(qiáng)（Chen 等，2018 年 b；Shinohara 等，2021 年）。

由于以往的研究主要關(guān)注腸-肝臟共培養(yǎng)后肝臟類器官代謝活動(dòng)的增強(qiáng)（Shinohara 等，2021 年），我們重點(diǎn)關(guān)注轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP，它們介導(dǎo)外源性物質(zhì)從肝臟細(xì)胞的清除（Jetter 和 Kullak-Ublick，2020 年）。我們的結(jié)果清楚地表明，2OC 模型能夠模擬口服后有毒危害的吸收，并且上清液易于保存，以便用于人類生物標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)。

選擇該濃度的原因如下：1）在測(cè)試濃度下，腸屏障的完整性不會(huì)受損；2）該藥物對(duì)肝臟的毒性作用高于對(duì)腸的毒性作用。盡管對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的吸收在很大程度上受胃排空的影響（Toes 等，2005 年），但它主要通過(guò)近端小腸的被動(dòng)擴(kuò)散被吸收（M′esza′ros等，2022 年）。在體外，高濃度的 APAP 已被證明會(huì)降低肝臟細(xì)胞活力（Bell 等，2020 年）。低劑量下，APAP 顯示出有限的毒性作用；然而，過(guò)量或?yàn)E用藥物時(shí)，APAP 會(huì)導(dǎo)致急性嚴(yán)重的肝臟細(xì)胞損傷（Bunchorntavakul 和 Reddy，2018 年）。隨著時(shí)間的推移，暴露濃度與毒性作用之間的關(guān)系可以解釋時(shí)間依賴性毒性的風(fēng)險(xiǎn)以及化學(xué)品的分子機(jī)制（Tennekes 和 Sánchez-Bayo，2013 年）。APAP 的濃度對(duì)于反映藥物暴露情況至關(guān)重要；因此，我們檢測(cè)了 APAP 的轉(zhuǎn)運(yùn)情況（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年）。

對(duì)乙酰氨基酚（APAP）具有良好的口服生物利用度（88%），因?yàn)樗鼙涣己梦眨跀z入后90分鐘內(nèi)達(dá)到血漿濃度峰值（Hodgman和Garrard，2012）。在我們的研究中，我們的2OC模型（24 ±11.31 h）中的Tmax預(yù)測(cè)值高于臨床數(shù)據(jù)（0.33-4 h）和其他2OC芯片的結(jié)果（6 h）（Marin等，2019）。APAP在治療劑量下吸收迅速，隨著劑量的增加而減緩（Rosenberg等，1981）。在治療劑量下，APAP的血漿半衰期在1.5到2.5小時(shí)之間；然而，我們檢測(cè)到24小時(shí)后兩個(gè)腔室的藥物濃度平衡，與之前的研究結(jié)果一致。Rawlins等（1977）測(cè)量了志愿者口服APAP（500、1000和2000毫克）后的血漿濃度，結(jié)果表明2000毫克時(shí)Tmax延遲。一些病例報(bào)告顯示，過(guò)量服用APAP制劑會(huì)導(dǎo)致血漿濃度峰值延遲和APAP吸收延長(zhǎng)（Chiew等，2010；Graudins等，2010；Roberts和Buckley，2008）。Mazaleuskaya等（2015）總結(jié)說(shuō)，由于APAP過(guò)量后代謝受損，半衰期延長(zhǎng)至4-8小時(shí)。選擇了一種無(wú)腸毒性的肝臟毒性劑量，其給藥濃度（對(duì)乙酰氨基酚，4 毫摩爾，604.64 毫克/升）約為中毒血漿濃度（100 - 150 毫克/升）的四到六倍，以及昏迷致命血漿濃度（200 - 300 毫克/升）的二到三倍（Schulz 等，2020 年）。由于體外對(duì)乙酰氨基酚的毒性濃度（Bell 等，2020 年）遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人體的治療血漿濃度（5 - 25 毫克/升）（Schulz 等，2020 年），在我們的研究中，48 小時(shí)內(nèi)未觀察到明顯的藥物消除過(guò)程。藥代動(dòng)力學(xué)（PK）的輔助證據(jù)表明，芯片模型需要進(jìn)一步修改，特別是要進(jìn)一步研究體外和臨床數(shù)據(jù)向臨床的轉(zhuǎn)換方法，以提高體外結(jié)果與臨床的相關(guān)性。

最后，我們檢測(cè)了我們的設(shè)備對(duì)肝臟球體細(xì)胞的毒性作用。與 96 孔板相比，2OC 芯片中球體細(xì)胞的存活率略有提高，具體反映了藥物毒性隨藥物濃度和時(shí)間暴露的變化。過(guò)量攝入對(duì)乙酰氨基酚（APAP）會(huì)顯著增加血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平（Acheampong 和 Thomas，2016；Stockman，2008）；然而，在 2OC 模型中暴露 48 小時(shí)后，AST 和 ALT 水平略有增加。同時(shí)，ALB 的下調(diào)表明肝臟的代謝功能受到抑制，并且發(fā)生了嚴(yán)重的肝臟損傷。這種下降與之前的一份報(bào)告（Wu 等，2022 年）一致。藥物遞送后，最外層細(xì)胞的Ki67（細(xì)胞分裂所必需的） 信號(hào)減弱，表明最外層細(xì)胞的增殖受到抑制。最初，我們?cè)诩毙砸认傺字委熀髾z測(cè)到受阻的肝臟球體。

在治療劑量下，對(duì)乙酰氨基酚主要通過(guò)葡萄糖醛酸化和硫酸化轉(zhuǎn)化為無(wú)毒代謝產(chǎn)物。對(duì)乙酰氨基酚被 CYP2E1 酶氧化并激活為有毒產(chǎn)物 N-乙酰天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（NAPQI）。NAPQI 耗盡谷胱甘肽（GSH）并將其轉(zhuǎn)化為對(duì)乙酰氨基酚半胱氨酸。當(dāng) GSH 低于正常水平的 30%時(shí)，NAPQI 不再被還原，引發(fā)毒性反應(yīng)。盡管在動(dòng)物血清和器官中可檢測(cè)到 NAPQI（Russomanno 等，2023 年；Zhang 等，2018 年），但除了在原代肝臟細(xì)胞中（Pingili 等，2019 年），在細(xì)胞系中檢測(cè)到這種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物仍然困難（Zhang 等，2020 年）。如前所述（Zhang 等，2020 年），只有少量的對(duì)乙酰氨基酚轉(zhuǎn)化為 NAPQI，其半衰期極短（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年）。它可以在 130 毫秒內(nèi)迅速且輕易地通過(guò)與 GSH 結(jié)合而被解毒（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年），或者通過(guò) NADPH、二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原酶還原回對(duì)乙酰氨基酚（Zhang 等，2020 年），因此在其體外模型中檢測(cè) NAPQI 存在困難（Zhang 等，2020 年）。在谷胱甘肽（GSH）耗竭之后會(huì)發(fā)生 APAP 蛋白結(jié)合，這是肝臟毒性機(jī)制中的一個(gè)早期事件（Jaeschke 等，2014 年；McGill 等，2013 年）。作為一種替代的體外模型，GSH 耗竭（Leclerc 等，2015 年）、氧化能力（Geib 等，2021 年；Leclerc 等，2015 年）、共價(jià)蛋白結(jié)合（Geib 等，2019 年、2021 年；Pierce 等，2002 年）以及使用系統(tǒng)生物學(xué)模型獲取的體外毒性信息（Leclerc 等，2015 年），可能是追蹤或提示 NAPQI 形成和積累的替代方法。NAPQI 與線粒體蛋白結(jié)合以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酰化，這會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞壞死或氧化應(yīng)激以及線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和肝臟損傷（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年；Saito 等，2010 年）。在急性胰腺炎（APAP）誘導(dǎo)的肝臟毒性發(fā)病過(guò)程中，肝臟細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激（Shan 等，2018 年；Ye 等，2018 年）。治療后，肝臟模型中TMRE信號(hào)的降低表明肝臟細(xì)胞（尤其是側(cè)細(xì)胞）的線粒體膜電位降低，線粒體功能受到影響。線粒體膜電位表示線粒體活性的變化和線粒體穩(wěn)態(tài)的破壞（Vianello等，2023）。在急性肝臟功能衰竭的早期階段，線粒體膜電位降低，導(dǎo)致線粒體形態(tài)變化并影響線粒體功能，這是肝臟細(xì)胞損傷的初始信號(hào)（Li等，2011；Umbaugh等，2021）?？紤]到急性肝臟功能衰竭引起的氧化應(yīng)激會(huì)損害蛋白質(zhì)折疊并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Ferret，2001；Ye等，2018），我們使用CellROX來(lái)定位活性氧信號(hào)，并在急性肝臟功能衰竭組中觀察到大量活性氧信號(hào)的分布。這些結(jié)果表明，使用2OC芯片模擬急性肝臟功能衰竭過(guò)量后，可以在肝臟模型中檢測(cè)到線粒體膜電位和細(xì)胞氧化應(yīng)激的變化。

在急性肝臟功能衰竭的早期階段會(huì)發(fā)生肝臟細(xì)胞凋亡（Possamai 等，2013 年）。急性肝臟功能衰竭（APAP 誘導(dǎo)）會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽（GSH）耗竭，APAP 觸發(fā)線粒體毒性通路和過(guò)程，將半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3/7 前體轉(zhuǎn)化為活性裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Baek 等，2016 年）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其前體酶形式在轉(zhuǎn)化為活性形式之前會(huì)被裂解（Fernandes-Alnemri 等，1994 年）。腫瘤抑制基因 p53 通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡（Arakawa，2005 年）。APAP 誘導(dǎo)的肝臟毒性可能導(dǎo)致 p53 的輕微上調(diào)（Chen 等，2018a）。APAP 給藥后，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 蛋白信號(hào)顯著增加，p53 信號(hào)略有增強(qiáng)，表明 APAP 誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡信號(hào)。

然而，不可否認(rèn)的是，動(dòng)物模型為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理解和進(jìn)步做出了重大貢獻(xiàn)，尤其是在過(guò)去幾十年中，對(duì)于藥物和化學(xué)品的安全性評(píng)估而言，這可能是替代性體外模型無(wú)法取代的。盡管這些新模型已經(jīng)并將繼續(xù)在生物醫(yī)學(xué)和監(jiān)管研究中發(fā)揮重要作用，允許對(duì)一種物質(zhì)的系列影響進(jìn)行研究，并提供高靈敏度，不受其他生物現(xiàn)象的干擾（Kaplan 等，2024 年）。另一方面，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，2OC 模型肯定還無(wú)法取代現(xiàn)有的生物模型，而是作為一種研究工具，提前提供特定的見(jiàn)解，以減少藥物篩選所需的動(dòng)物數(shù)量。我們的結(jié)果表明，2OC 模型可以使用熒光探針測(cè)量藥物吸收并檢測(cè)與多種毒性相關(guān)的信號(hào)變化，展示了多器官芯片作為輔助證據(jù)同時(shí)檢測(cè)藥物療效/毒性和藥代動(dòng)力學(xué)潛力的可能性。

5. 結(jié)論

我們建立了一個(gè)腸-肝臟二聯(lián)器官芯片系統(tǒng)，并通過(guò)模擬過(guò)量對(duì)乙酰氨基酚（APAP）后的急性肝臟損傷過(guò)程來(lái)評(píng)估其毒性作用。通過(guò)共培養(yǎng) Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞建立了腸類器官，并用 HepG2、HUVEC-T1、PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞和 HHSC 建立了肝臟球體類器官。在多器官芯片組中，肝臟類器官中 PGP、MRP2 和 CYP3A4 的表達(dá)略有改善。在獲得兩個(gè)腔室中 APAP 的濃度-時(shí)間曲線后，使用 NCA 法擬合毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù) Tmax、Cmax 和 AUC。APAP 處理增加了肝臟毒性生物標(biāo)志物 AST 和 ALT 的水平，減少了白蛋白（ALB）的分泌，抑制了細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了活性氧（ROS）信號(hào)，降低了線粒體膜電位，激活了 caspase-3，并增強(qiáng)了 p53 信號(hào)。本研究為器官芯片在藥物毒性研究中的應(yīng)用提供了輔助證據(jù)，同時(shí)檢測(cè)藥物含量和毒性反應(yīng)，為預(yù)測(cè)候選化合物的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)特性提供了潛力。